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GEO表达谱芯片多个联合分析

时间:2017-06-05 14:08来源:原创 作者:BioWolf 点击:
GEO表达谱芯片分析的技术非常成熟,发表的相关论文也非常多,如果需要深入研究GEO表达谱芯片,多芯片联合分析提供了很好的思路,这样得到的差异基因,更加具有说服力;同时可以联合TC

一、查找和下载数据

    GEO搜索关键字“(gastric cancer)AND "Homo sapiens"[porgn:__txid9606]”,得到胃癌相关的表达谱数据。对这些数据进行过滤,过滤掉没有重复试验的样品。接下来,阅读文献,找出研究正常人和癌症病人,或者癌组织与正常组织的比较的数据。下载这些数据的表达矩阵或CEL文件,用于后续的分析

1用于分析的数据

GEO芯片信息

注:

Series              序列号

GEO               GEO id

Platforms          芯片平台号

Normal            正常样品数目

Tumor             癌症样品数目

Reference          参考文献
二、数据处理

    对于芯片表达值数据,直接从GEO下载数据,对于没有取log的值,进行取log处理。对于CEL文件,使用affy包读取CEL文件的表达量数据。在同一芯片内,如果一个基因有多个探针,取所有探针的平均值作为基因的表达值。

差异表达

对于每个实验的数据,我们使用limma进行芯片之间的标准化,差异表达分析(每个实验的limma分析结果保存在01_limma里面)

每个实验数据做完limma分析之后,根据logFoldChange值对基因进行排序,然后进行Rank分析(adjust Pvalue<0.05,矫正方法为bonferroni矫正法)Rank方法的零假设是每个基因在每个实验中随机排序,如果某个基因在所有实验中,都排在前面,那么它的p值越小,是差异基因可能性越大。

通过Rank分析,我们共找到960个差异基因,其中458个上调基因,502个下调基因。

使用pheatmap绘制最上调和最下调的20个基因做热图,得到差异基因的热图。从图中可以看出,上调的基因基本在所有实验中logFC>0,而下调的基因基本在所有的实验中logFC<0

 

差异基因列表

差异基因表格截图

注:

Name               gene symbol

logFC               每个实验差异logFC均值

Pvalue              统计学p

adjPvalue           校正后的p

GEO联合分析热图

1 logFC热图

横坐标是geo id,纵坐标是基因名,红色代表logFC>0,绿色代表logFC<0,方框里面的数值代表logFC值。


三、TCGA验证差异基因

TCGA下载胃癌level3RNA-seq数据,共xx个正常组织,xx个肿瘤组织。下载的数据是每个样品单个的FPKM文件,我们使用perl语言将所有的样品合并成一个矩阵,便于后续的分析。接下来,我们使用Wilcoxon tests非参数检验对GEO数据库得到差异基因进行验证。

通过TCGA验证,我们共找到749个差异基因,其中320个上调基因,429个下调基因。

3 TCGA验证差异基因

TCGA差异分析表格截图

注:

Name               gene symbol

logFC               每个实验差异logFC均值

Pvalue              统计学p

adjPvalue           校正后的p

 

四、生存分析

    TCGA下载生存数据,并将生存数据和差异基因表达数据整合在一起,做接下来的生存分析。使用survival R包进行生存分析并绘制生存曲线,统计检验为log rank检验,过滤条件为Pvalue<0.01。通过分析,共找到168个与胃癌生存相关的差异基因,结果保存在04_TCGAsurvival/survival.xlsx里面168个生存相关基因的生存曲线保存在04_TCGAsurvival/picture目录下。

癌症图谱生存曲线

图2 生存分析

图中,横坐标是生存时间,纵坐标是总生存率,红色表达基因高表达组,蓝色代表低表达组。

 

五、GO富集分析

使用DAVID对目标靶基因进行GO功能富集分析,FDR<0.05被作为筛选条件,我们共找到5个相关的GO,(即“extracellular space”、“digestion”等),使用ggplot2 R包绘制GO富集柱状图。5个相关GO表格GO富集柱状图保存在diffSig\GO\GO.xls目录下。

 

5 GO富集结果

GO功能富集

注:

Term                 富集的GO

Count                差异基因落在Term的数目

PValue               富集统计学p

FDR                 统计FDR(false discovery rate)

 

KEGG富集通路

3 GO富集柱状图

    横坐标是富集在GO的基因数目,纵坐标是富集的GO。颜色代表富集的统计学显著性,越蓝表示富集程度越高。

 

六、KEGG富集分析

使用KOBAS对差异基因进行KEGG通路富集分析,CorrectedP-Value<0.05被作为筛选条件。我们共找到23个相关的KEGG,富集的表格保存在diffSig\KEGG\KEGG.xlsx目录下,最富集通路hsa04971图保存在diffSig\KEGG\hsa04971.png目录下。如果需要查看其它富集通路的通路图,可以打开差异diffSig\KEGG\KEGG.xlsx,点击相应通路的Hyperlink链接即可。

6 KEGG富集结果

KEGG富集结果截图

注:

Term                         富集的KEGG

ID                            KEGG ID

P-Value                       富集统计学p

CorrectedP-Value              矫正后的p

KEGG通路

4 hsa04971通路图

    绿色代表通路中的基因,红色代表我们输入的生存相关基因。

 

七、蛋白互作网络

使用String软件对生存相关基因构建蛋白互作网络,得到蛋白的相互作用关系。图1是蛋白互作网络图,图中圆圈代表蛋白,连线蛋白蛋白之间存在互作关系。使用R软件绘制互作网络邻接节点数目图,图2是每个蛋白的邻接节点数目,邻接节点数目越多,说明该基因位于蛋白互作网络的核心,对整个网络起的作用最关键。由图2可以看出,CFTRSSTTIMP1等位于网络的最核心。蛋白互作网络图和互作网络邻接节点数目图、互作网络邻接节点数表格保存在diffSig\蛋白互作网络目录下。

蛋白互作网络

蛋白相互作用网络图

    圆圈代表基因,线条代表基因间存在蛋白相互作用,圆圈内部的结果代表蛋白的结构。线头颜色代表证明蛋白之间存在相互作用的不同证据。(small nodes:protein of unknown 3Dstructure; large nodes: some 3D structure is known or predicted; A red lineindicates the presence of fusion evidence ; a green line - neighborhoodevidence; a blue line - coocurrence evidence; a purple line - experimentalevidence; a yellow line  text mining evidence; a light blue line -database evidence; a black line - coexpression evidence.)

核心基因柱状图

互作网络邻接节点数目

横坐标是基因的邻接节点数目,纵坐标是基因名称。


责任编辑:森莘
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